單細胞測序技術能夠揭示單個細胞的基因表達狀態(tài)蔗包，反映細胞間的異質性链患，發(fā)現(xiàn)新的稀有細胞類型。當前單細胞測序技術的一個限制是需要組織解離晴叨，導致空間信息的丟失睹欲。為了解決這個問題，空間轉錄組學平臺則保留了空間結構耻矮，從而允許以前所未有的深度分析腫瘤與腫瘤微環(huán)境的相互作用芯肤。
下面分享一篇在?Cancer Discovery?上發(fā)表的題為：Single-cell atlas of lineage states, tumor microenvironment and subtype-specific expression programs in gastric cancer 的研究論文。
科學問題
胃癌（GC）是導致全球癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因遍略，其表現(xiàn)出高水平的患者間和患者內(nèi)的異質性惧所。通過前期群體測序已知每個胃腫瘤樣本都具有獨特的表達譜骤坐。然而，我們對腫瘤微環(huán)境（TME）中各細胞類型如免疫細胞下愈、成纖維細胞等驅動 GC 表型的機制的理解仍處于初級階段纽绍。
技術方法及路線
主要結論
1、scRNA-seq 識別異質性細胞群势似、細胞命運軌跡和稀有細胞群
40 個樣本的 152,423 個細胞降維拌夏，分成34 個群（圖 1B），5 種細胞大類履因，各細胞類型在組間占比不同（圖 1C）障簿。漿細胞群的單細胞擬時序分析表明了漿細胞分化和成熟的不同階段（圖 1E)。此外栅迄，鑒定到一種新型稀有細胞類型 STF4站故。STF4 細胞群表達?PLVAP（內(nèi)皮細胞標志物）和?RGS5（成纖維細胞標志物），暗示了一種罕見的混合譜系群體（圖 1F）毅舆。作者也使用雙色 RNAScope 技術驗證了?PLVAP/RGS5?雙陽性群體的存在西篓。STF4 細胞群可能突出顯示經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質轉化（EndoMT）的細胞，這是一個內(nèi)皮細胞獲得間充質或肌成纖維細胞表型的過程憋活。綜上岂津，這些結果展示了 scRNA-seq 揭示異質性細胞群、細胞命運軌跡以及稀有細胞群的能力悦即。
2、scRNA-seq 識別胃癌細胞特異性轉錄
與正常組相比辜梳，腫瘤中上皮細胞的比例較低粱甫，骨髓細胞較高。淋巴樣冗美、血漿和基質細胞的比例沒有差異魔种。與正常組織相比，腫瘤相關上皮細胞表現(xiàn)出更高致癌基因特征表達（圖 2B）粉洼。GC 癌基因（如?CEACAM6节预、EGFR、MET属韧、CCND1?和KRAS?）的表達在 EpiInt1 腫瘤上皮細胞亞群上調(diào)最大（圖 2C）安拟。與正常相比，腫瘤相關上皮細胞表現(xiàn)出顯著異常 CNV（圖 2D）宵喂。比較同一細胞類型組間（腫瘤組和正常組）差異顯示糠赦，“主要細胞”和“腸型細胞”差異最大（圖 2E）。LIPF 和 PGA3 在腫瘤中下調(diào)（圖 2F）。使用 DSP 空間轉錄組技術拙泽，作者證實了與正常樣本相比淌山，腫瘤上皮細胞（PanCK+）中?LIPF?的下調(diào)表達（圖 2G）。成纖維細胞細分三個亞群（圖 2H）顾瞻。綜上泼疑，在 GC 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中，來自上皮和腫瘤微環(huán)境的不同細胞表達不同的致癌轉錄組學特征 —— 每種特征都是不同癌癥所必需的荷荤，并最終會混合以產(chǎn)生復合腫瘤分子圖譜（圖 2I)退渗。
3、scRNA-seq 揭示彌漫型胃癌中?KLF2?相關的漿細胞富集
與腸型 GC 相比蕴纳，彌漫型 GC 中漿細胞相對比例更高会油，上皮細胞較低，淋巴古毛、骨髓和基質細胞群沒有差異（圖 3A）翻翩。使用 IRF4（漿細胞標記物）免疫組化（圖 3B）證實了彌漫型腫瘤中漿細胞水平的增加。重新分析 TCGA 中群體轉錄組數(shù)據(jù)喇潘，進一步驗證了彌漫型 GC 中漿細胞水平的增加（圖 3C）体斩。單細胞數(shù)據(jù)表明彌漫型 GC 中漿細胞的富集主要由漿細胞簇 PL4 和 PL5 驅動（圖 3D）。KLF2?是一種先前顯示可調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤中漿細胞歸巢的基因颖低。作者觀察到漿細胞比例與表達?KLF2?的上皮細胞之間存在顯著相關性（圖 3E）。這一發(fā)現(xiàn)表明弧烤，高表達?KLF2?的上皮細胞可能與彌漫型 GC 中的漿細胞募集有關忱屑。ChIP-seq 和群體轉錄組測序發(fā)現(xiàn)彌漫型 GC?KLF2?H3K27ac 啟動子水平和基因表達均高于腸道 GC，啟動子信號和基因表達之間具有良好的相關性暇昂。分析 TCGA 群體轉錄組測序數(shù)據(jù)進一步證實與腸型腫瘤相比莺戒，彌漫型腫瘤?KLF2?表達增加（圖 3F）。為了探索空間環(huán)境中?KLF2?的差異急波，作者使用 DSP 空間轉錄組技術來分析?KLF2?在上皮細胞（Pan-CK+）中的表達从铲。結果證實與腸型上皮細胞相比，彌漫型上皮細胞中的?KLF2?轉錄水平更高（圖 3G）澄暮。此外名段，作者觀察到與遠端上皮細胞相比，靠近漿細胞的上皮細胞中?KLF2?表達更高（p = 0.096）（圖3H）泣懊。進一步作者通過人源化小鼠模型及細胞共培養(yǎng)體外遷移實驗證明腫瘤上皮細胞中?KLF2?表達與宿主漿細胞之間的關系（圖 3I-J）伸辟。總之馍刮，研究結果確定了彌漫型 GC 中漿細胞募集信夫，上皮細胞?KLF2?表達作為漿細胞募集的潛在驅動因素。
4、scRNA-seq 揭示了不同的成纖維細胞亞群和?INHBA-FAP作為腫瘤成纖維細胞調(diào)節(jié)因子
作者根據(jù)臨床分期和組織學亞型比較了 scRNA-seq 中的腫瘤成纖維細胞亞群（STF1-3）静稻，結果表明三個亞群都呈階段性增加（圖 4A）警没。STF1 和 STF3 簇表現(xiàn)出?FAP、ACTA2振湾、TAGLN?的上調(diào)惠奸，STF2 簇僅表現(xiàn)出?CSPG4?的上調(diào)（圖 4B）。據(jù)報道恰梢，TGF-β 超家族信號會影響其他癌癥類型中的腫瘤成纖維細胞（CAF）的功能佛南。因此，作者選擇研究 TGF-β 通路的主要組成部分激活素-抑制素信號傳導模塊嵌言，包括 9 個經(jīng)典基因嗅回。在這 9 個基因中，與正常相比摧茴，只有?INHBA?在腫瘤相關的 STF2 和 STF3 簇中表現(xiàn)出顯著上調(diào)（圖 4C）绵载。INHBA?與STF3 中的?FAP?呈顯著正相關，而與 STF2 中的?CSPG4?未發(fā)現(xiàn)相關性苛白⊥薇空間 DSP 數(shù)據(jù)分析表明?FAP?和?INHBA?在腫瘤成纖維細胞（SMA+）中的表達高于正常（圖 4D-F），并且在腫瘤成纖維細胞中?FAP?和?INHBA?共表達水平存在很強的相關性（圖 4G）购裙。作者進一步通過體內(nèi)外系列功能實驗表明?INHBA?正調(diào)節(jié)胃癌?STF3?成纖維細胞群中?FAP?表達（圖4H-J）懂版。研究還發(fā)現(xiàn)從正常到 IV 期 STF3 中?FAP?和?INHBA?表達增加（圖 4K）。通過?INHBA?表達水平對 TCGA 樣本進行的生存分析顯示躏率，具有高?INHBA?表達的腫瘤樣本的生存率顯著降低（圖 4L）躯畴。
5、胃癌類器官的 scRNA-seq
為了研究與體內(nèi)原代腫瘤相比薇芝，體外類器官培養(yǎng)條件對轉錄狀態(tài)或整體細胞比例的影響蓬抄，作者將來自患者類器官（PDO）的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集與原發(fā)腫瘤進行整合分成五個主要的細胞群（圖 5A）。與正常 PDO 上皮細胞相比夯到，腫瘤 PDO 上皮細胞表現(xiàn)出癌癥相關模塊和 GC 相關基因的上調(diào)（圖 5B）嚷缭。對正常和腫瘤 PDO 中上皮細胞的軌跡圖分析表明，來自腫瘤類器官的上皮細胞相對于正常上皮細胞具有多個分支耍贾，這與正在經(jīng)歷普遍和持續(xù)分化或去分化的腫瘤 PDO 上皮細胞一致（圖 5C）阅爽。研究者進一步揭示了原發(fā)腫瘤和 PDO 之間的差異（圖 5D-G）”普總之优床，這些結果提出了一種可能性，即除了上皮細胞外誓焦，PDO 培養(yǎng)也可能影響與腫瘤相關的其他細胞類型的轉錄譜胆敞。
總結
該研究對超過 30 名具有不同亞型和階段的胃癌患者的擴展隊列進行了 scRNA-seq着帽，跨越大量細胞（＞200,000 個細胞）生成了全面的胃癌單細胞圖譜。共鑒定到34個細胞群移层，包括新的稀有細胞群仍翰。觀察到彌漫型腫瘤中漿細胞比例增加，以及以高?INHBA?和?FAP?共表達為特征的癌癥相關成纖維細胞亞群的分期積累观话。單細胞分析比較了患者來源的類器官（PDO）和原發(fā)性腫瘤之間的相似性和差異予借。通過 DSP 空間轉錄組學、獨立的群體 RNA-seq 以及體外和體內(nèi)模型的功能實驗來補充這些發(fā)現(xiàn)频蛔。該研究提供了跨不同胃癌亞型的患者內(nèi)部和患者間單細胞高分辨率分子圖譜灵迫。
