這是MSK于2019年發(fā)表于《nature medicine》的一篇文章《高深度測序揭示血漿中cfDNA變異的來源》风皿，文章設(shè)計實驗對cfDNA變異的來源進(jìn)行了分析雕什，揭示了克隆性造血突變對cfDNA突變檢出的影響，強(qiáng)調(diào)了WBC作為配對的重要性鸯屿，是一篇非常經(jīng)典的學(xué)習(xí)文獻(xiàn)坚芜。

1 摘要

想要準(zhǔn)確鑒定血漿中腫瘤驅(qū)動的 somaitc 突變，需要理解不同生物過程對cfDNA的貢獻(xiàn)餐曼。文章想確認(rèn)cfDNA和配對白細(xì)胞高深度測序方法的可行性，在124例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的前瞻性研究中鲜漩，對基因組較大的一個區(qū)域進(jìn)行了高深度測序（508個基因，2Mb區(qū)域大小集惋，>60000初始深度）孕似，也進(jìn)行了同期配對腫瘤組織和47個無腫瘤對照的分析。結(jié)果顯示該方法有較高靈敏度和特異性刮刑，可以檢測腫瘤來源的突變喉祭，推斷bTMB，bMSI雷绢，腫瘤信號及腫瘤驅(qū)動的 somaitc 突變泛烙。大多數(shù)的cfDNA突變（81.6%在對照中，53.2%在癌癥病人中）顯示出與克隆性造血CH（clonal hematopoiesis）相一致的特征翘紊。這種cfDNA測序方法揭示了克隆性造血是一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象蔽氨，強(qiáng)調(diào)了cfDNA-白細(xì)胞配對測序?qū)?zhǔn)確檢測變異的重要性。

2 引言

癌癥病人血漿中的循環(huán)cfDNA是腫瘤驅(qū)動DNA的潛在來源帆疟。大規(guī)模平行測序cfDNA表明ctDNA只占整個cfDNA的很小一部分鹉究，這一比例隨疾病負(fù)荷、部位和腫瘤生物學(xué)特征（包括組織學(xué)踪宠、血管化自赔、增殖和凋亡）而變化。ctDNA在許多癌癥的早期和一些轉(zhuǎn)移性癌癥中比例極低柳琢，需要高靈敏度的方法才能檢測到绍妨。即使使用準(zhǔn)確的cfDNA檢測方法润脸，cfDNA結(jié)果仍可能與體細(xì)胞嵌合體產(chǎn)生的生物信號混淆。體細(xì)胞嵌合體的一種形式是克隆性造血(CH)他去，這是克隆繁殖后代的造血干細(xì)胞 somatic 突變累積的結(jié)果毙驯。這些體細(xì)胞突變可能為某些造血干細(xì)胞和其后代細(xì)胞提供適應(yīng)性優(yōu)勢，導(dǎo)致其無序的擴(kuò)張孤页。CH 隨著年齡的增長而增加尔苦，在31%的老年人中發(fā)生，也可以在cfDNA中檢測到行施。在這種情況下允坚，它可能會混淆cfDNA突變，因為很大一部分cfDNA的片段都來自于造血細(xì)胞蛾号。

cfDNA樣本與腫瘤組織活檢中的somatic突變存在較好的一致性稠项。腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)somatic變異，但cfDNA發(fā)現(xiàn)的情況鲜结，文獻(xiàn)中也有記載展运。但是，它們的特征和來源并沒有被確認(rèn)精刷。在這里拗胜，文章報導(dǎo)了cfDNA和配對白細(xì)胞高深度測序檢測cfDNA中somatic的方法，不需要預(yù)先知道配對組織中的突變怒允。該方法結(jié)合FDA授權(quán)的TN配對的靶向測序方法埂软，允許對ctDNA突變來源進(jìn)行分類和定量。

3 結(jié)果

3.1 實驗設(shè)計信息

1纫事、血漿的cfDNA 和轉(zhuǎn)移性乳腺癌MBC勘畔，非小細(xì)胞肺癌NSCLC，前列腺癌CRPC配對的白細(xì)胞gDNA同時進(jìn)行GRAIL 508基因 panel的靶向測序
2丽惶、在沒有進(jìn)行干預(yù)治療的情況下炫七，腫瘤組織和配對白細(xì)胞采用MSK-IMPACT panel（410個基因） 進(jìn)行靶向測序
3、39個MBC钾唬，41個NSCLC万哪，44個CRPC樣本；47個 cfDNA對照樣本知纷。如圖 Fig1a 所示：

3.2 腫瘤來源 cfDNA 突變的從頭檢測

1壤圃、 為了確認(rèn)cfDNA中腫瘤來源的somatic 突變，對cfDNA琅轧，WBC gDNA 和 配對組織和白細(xì)胞進(jìn)行了獨立測序
2伍绳、cfDNA和WBC gDNA采用 UMI標(biāo)簽進(jìn)行測序，初始去重前測序深度在60000X左右
3乍桂、使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法對cfDNA和WBC gDNA配對的突變進(jìn)行檢測冲杀， 結(jié)果顯示該方法具有高靈敏度Fig1bc(HD753細(xì)胞系模擬數(shù)據(jù))效床，低假陽性，高重復(fù)性Fig1de权谁，與ddpcr的結(jié)果相一致Fig1f剩檀；高深度測序結(jié)果顯示，每個堿基的錯誤率范圍為110^-5 到 310^-5 旺芽，性能可與其他高可信度cfDNA測序相媲美沪猴。
4、既在腫瘤組織檢出也在血清中檢出的突變在 MBC,NSCLC,CRPC 分組和整理中的比例如Fig2a所示采章，具體基因檢出的一致性如Fig2b所示运嗜，這也表明組織和cfDNA中基因突變的一致性還是比較高的
5、cfDNA檢出的比例與組織樣本中癌細(xì)胞的比例（CCFs）高度一致悯舟，如Fig2e所示
6担租、以上數(shù)據(jù)證明，cfDNA測序方法有較高的靈敏度去檢測來自于組織中腫瘤亞克隆來源的somatic突變

3.3 腫瘤突變負(fù)荷 TMB 和突變特征

文章對能否單獨使用cfDNA測序確定TMB抵怎，突變特征奋救，bMSI值進(jìn)行了探索。
1反惕、組織和cfDNA的TMB突變特征分布如圖Fig3a尝艘。其中有6個樣本在cfDNA中TMB值較高，在組織中TMB值較低姿染，可能的解釋是腫瘤的空間異質(zhì)性利耍，可能在一些轉(zhuǎn)移位點存在高突變特征
2、以上數(shù)據(jù)表明盔粹，cfDNA測序方法可以精確的檢測腫瘤來源的突變，有可能用于TMB程癌，MSI和突變特征分析舷嗡，并為治療手段的選擇提供信息

3.4 cfDNA變異的生物來源特征

變異檢測和tag邏輯：
1、變異覆蓋深度較低嵌莉，白細(xì)胞中頻率較高的點进萄，標(biāo)記為噪音
2、白細(xì)胞中锐峭，變異頻率大于20%的點被認(rèn)為是germline
3中鼠、同義突變被獨立標(biāo)記
4、變異在白細(xì)胞中存在沿癞，但是未達(dá)到閾值的標(biāo)記為 WBC matched
5援雇、如果白細(xì)胞中深度較低，不能提供足夠信息的標(biāo)記為模糊
6椎扬、剩余的突變標(biāo)記為Somatic惫搏，還分為以下三個種類：
如果在組織MSK中檢出的標(biāo)記為biopsy matched;
如果在組織MSK中低于閾值的標(biāo)記為biopsy subthreshold;
如果變異沒有匹配到信息的標(biāo)記為VUSOs具温；

1、在cfDNA病人中筐赔，somatic檢測的特異性不高只有24.4%（與組織Somatic檢測一致的個數(shù)占總Somatic的比例）
2铣猩、在沒有癌癥的controls中，TMB平均值為7.27茴丰。之前的研究表明达皿，這些突變可能是由超高深度測序?qū)е碌娜斯ね蛔儭５腔诜治龇椒ǖ奶禺愋曰呒纾恼录僭O(shè)這些變異來源于體細(xì)胞嵌合體（特別是克隆性造血）和空間異質(zhì)性引起的腫瘤來源突變（特別是在高突變癌種中）
3峦椰、克隆性造血一般與年齡相關(guān)，WBC matched顯示了與年齡的強(qiáng)相關(guān)性Fig4c尸曼。根據(jù)這個解釋们何，89.5%的病人中，83%的健康人中的cfDNA突變?yōu)榭寺⌒栽煅亟危鏔ig4b冤竹。
4、WBC matched中的大部分基因DNMT3A茬射，TET2鹦蠕，PPM1D和TP53 也與文獻(xiàn)中報導(dǎo)的克隆性造血基因一致，如圖Fig4d
5在抛、WBC matched中的cfDNA 的VAFs與WBCs中的VAFs相關(guān)
6钟病、很大一部分VUSOs可能來自于腫瘤，但是由于腫瘤的空間異質(zhì)性和抽樣偏倚刚梭，可能并沒有在活檢組織樣本中檢測到肠阱，如Fig2b。為了確定cfDNA檢測的VUSOs的準(zhǔn)確性朴读，使用ddpcr方法對結(jié)果進(jìn)行了正交驗證屹徘，發(fā)現(xiàn)兩種方法完全一致，如圖Fig4f所示
7衅金、以上數(shù)據(jù)表明噪伊，高深度cfDNA測序確定了CH突變是cfDNA中檢測到的非腫瘤突變最大來源，CH可能比以前文獻(xiàn)報導(dǎo)的低深度WBC測序方法更普遍氮唯。并且在cfDNA中能檢測到腫瘤活檢中缺失的亞克隆來源突變

3.5 WBC變異特征

1鉴吹、對白細(xì)胞進(jìn)行高深度測序分析是檢測源自CH體細(xì)胞突變的主要方法。至少有1個CH突變在99.1%的腫瘤病人WBC中和93.6%的健康人對照中被檢測到
2惩琉、DNMT3A和TET2基因是癌癥病人和正常人中檢測到的最高突變VAFs的基因豆励，如Fig5c
3、治療干預(yù)可能會導(dǎo)致特定類型CH的獲得琳水，PMM1D基因在癌癥患者的頻率要對照組肆糕，并且在接受放療和化療中基因突變的比例要高于未治療組般堆，如Fig5d

4 討論

1、目前大多數(shù)的臨床cfDNA panel只是針對少量的關(guān)鍵基因和熱點突變诚啃，并沒有納入白細(xì)胞測序淮摔。之前通過擴(kuò)大區(qū)域檢測范圍，堅定了出了大量腫瘤組織中不存在的變異始赎，并推斷為體細(xì)胞變異（存在的問題）
2和橙、文章采用了cfDNA和WBC gDNA聯(lián)合高深度測序分析的方法，來減少測序錯誤造垛。如果不考慮WBC的測序結(jié)果魔招，cfDNA測序結(jié)果會產(chǎn)生一些誤導(dǎo)，因為一些影響癌癥基因的克隆性造血突變可能會被當(dāng)做腫瘤來源的突變（如TP53突變）
3五辽、文章分析顯示办斑，在cfDNA中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)非腫瘤匹配的非同義突變在各自的WBC gDNA樣本中都有reads支持，這在癌癥患者和正常對照組中都存在杆逗。這些白細(xì)胞中有支持的突變基因大多與CH相關(guān)乡翅，并且這些突變與年齡分布有較強(qiáng)的相關(guān)性
4、這些WBC中有支持的CH基因變異罪郊，在不同患者中具有差異蠕蚜，這表明在基于cfDNA的臨床分析中，需要cfDNA配對的WBC DNA進(jìn)行測序分析
5悔橄、如果沒有WBC靶累，來自于非腫瘤來源的突變（如CH）會被當(dāng)做腫瘤來源，會影響cfDNA分析中TMB的計算和特征分析
6癣疟、文章還證明了VUSOs的多種來源挣柬，比包括腫瘤異質(zhì)性，極低水平的CH睛挚，細(xì)胞嵌合體和技術(shù)噪音凛忿。其中大多數(shù)的VUSOs是腫瘤相關(guān)的突變，主要來自于腫瘤亞克隆

5 參考文獻(xiàn)

[1] Razavi P , Li B T , Brown D N , et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nature medicine, 2019, 25(12):1-10.