A signature for pan-cancer prognosis based on neutrophil extracellular traps

基于中性粒細(xì)胞外陷阱的泛癌預(yù)后特征

發(fā)表期刊：J Immunother Cancer

發(fā)表日期：2022 Jun

DOI:? 10.1136/jitc-2021-004210

期刊相關(guān)信息

一、背景

????????眾所周知缔俄，腫瘤和宿主的免疫反應(yīng)之間存在著持續(xù)的相互作用，從而加速了腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。作為人類免疫系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞，中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用棒搜。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（NLR）的大多數(shù)臨床證據(jù)支持中性粒細(xì)胞促進(jìn)而不是抑制病情發(fā)展的觀點(diǎn)。NLRs的增加反映了造血功能向骨髓系統(tǒng)的偏離活箕，淋巴造血功能的下降力麸，免疫系統(tǒng)功能的下降，以及預(yù)后的不良。

????????中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）是一種從垂死的中性粒細(xì)胞中排出的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)末盔，由脫鈣的DNA染色質(zhì)組成筑舅，主要是為了殺死有害微生物。DNA染色質(zhì)通過瓜氨酸化而分解陨舱，然后與瓜氨酸化的組蛋白和含有顆粒狀酶的中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物一起從細(xì)胞中排出翠拣，這被稱為 "NETosis"。髓過氧化物酶（MPO）被記錄為形成NETs的一個(gè)基本要素游盲，它是一種血紅素過氧化物酶误墓，主要儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞的嗜氮顆粒中，當(dāng)中性粒細(xì)胞受到刺激時(shí)分泌出來益缎。

二谜慌、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

1）TCGA，n=8739莺奔，涉及32種腫瘤欣范，沒有急性骨髓性白血病的樣本；隨機(jī)分配了70%的樣本作為訓(xùn)練集（6117/8739）令哟，其余30%作為測(cè)試集（2622/8739）

2）從CGGA獲取651個(gè)膠質(zhì)瘤患者的樣本用于研究恼琼，包括mRNAseq_693和mRNAseq_325的數(shù)據(jù)集，分別有422和229名患者

3）從cbioportal下載1868例METABRIC乳腺癌樣本

4）從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索并獲得了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌的數(shù)據(jù)屏富，包括GSE12276（n=204）晴竞，GSE17705（n=298），GSE19615（n=115）狠半，GSE21653（n=266）噩死，GSE2990（n=189），GSE6532_U133A（n=741）神年，GSE7390（n=198）已维，GSE8894（n=138），GSE43767（n=69）已日，GSE19188（n=91）和GSE67061（n=150）

5）多個(gè)腫瘤組織微陣列的組織樣本被用于臨床驗(yàn)證衣摩，包含了肺腺癌（LUAD，58對(duì)）捂敌、三陰性乳腺癌（TNBC, 80對(duì)）艾扮、結(jié)腸腺癌（COAD，93個(gè)腫瘤樣本和87個(gè)相應(yīng)的鄰近正常組織）和腎臟腎透明細(xì)胞癌（KIRC占婉，90對(duì)）的腫瘤和鄰近的正常組織

2.實(shí)驗(yàn)流程

1）NETs-最初的生物標(biāo)志物：當(dāng)NETosis發(fā)生時(shí)泡嘴，死亡的中性粒細(xì)胞分泌出解聚的核染色質(zhì)和混合的細(xì)胞質(zhì)和顆粒成分；嗜中性粒細(xì)胞的基因集和NETosis相關(guān)基因集來自已發(fā)表的研究逆济，共匯聚了69個(gè)基因作為NETs的初始生物標(biāo)志物酌予。

2）預(yù)后NETs相關(guān)特征的構(gòu)建：對(duì)NETs相關(guān)基因采用了LASSO算法磺箕；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以評(píng)估TCGA泛癌癥訓(xùn)練系列中NETs特征的每個(gè)基因表達(dá)與患者疾病特異性生存（DSS）的關(guān)聯(lián)

3）生物過程的z-score評(píng)價(jià)：過整合特征基因表達(dá)來反映特定途徑的活性抛虫；采用R軟件包GSVA中的z-score算法

4）使用組織微陣列分析和免疫組化染色進(jìn)行驗(yàn)證

5）NETs得分高和低的患者之間不同表達(dá)的基因的功能注釋: 使用R軟件包'clusterProfiler'進(jìn)行基因本體（GO）富集分析松靡，基于高危組和低危組之間的差異表達(dá)基因（DEGs）

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01 - 鑒定19基因NETs相關(guān)特征的泛癌

????????首先建椰，將69個(gè)NETs初始生物標(biāo)志物輸入TCGA泛癌訓(xùn)練集的LASSO回歸分析中（圖1A）雕欺，得到24個(gè)系數(shù)不為零的NETs相關(guān)基因。隨后棉姐，對(duì)這些基因進(jìn)行了配對(duì)相關(guān)分析屠列，發(fā)現(xiàn)一些基因有類似的表達(dá)模式（圖1B）。CTSG和SELP伞矩、IL-6和IL-8笛洛、IL-6和FRP2、TLR4和FPR1乃坤、FCGR3B和FPR1苛让、FCGR3B和FPR2、FPR1和FPR2之間的相關(guān)系數(shù)都比其他的高湿诊。因此蝌诡，刪除了CTSG、IL-6枫吧、TLR4、FPR1和FCGR3B宇色，并使用剩余的19個(gè)NETs相關(guān)基因進(jìn)行進(jìn)一步的模型構(gòu)建九杂。對(duì)19個(gè)NETs相關(guān)基因進(jìn)行Cox回歸分析，并根據(jù)其歸一化表達(dá)水平得出分?jǐn)?shù)（NETs分?jǐn)?shù)）宣蠕。此外例隆，還觀察了每個(gè)基因?qū)︻A(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）（圖1C）。MPO在NETosis中十分重要抢蚀，也參與了該模型镀层。

圖1 構(gòu)建泛癌癥的NETs -特征

????????NETs評(píng)分顯示出明顯的器官特異性，源自腦部和胃腸道的腫瘤通常具有較高的NETs評(píng)分皿曲，而來自一些分泌腺體的腫瘤唱逢，如前列腺腺癌、甲狀腺癌和乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）屋休，通常具有較低的評(píng)分（圖2A）坞古。TCGA訓(xùn)練隊(duì)列中的病人根據(jù)NETs評(píng)分中位數(shù)被分為高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)組。與低風(fēng)險(xiǎn)組的患者相比劫樟，高NETs評(píng)分的泛癌癥患者與各種不良生存指標(biāo)有關(guān)痪枫，包括DSS织堂、總生存期（OS）和無進(jìn)展間隔（PFI）（圖2C）。NETs評(píng)分對(duì)各種預(yù)測(cè)預(yù)后的影響的單變量Cox分析結(jié)果顯示奶陈，在大多數(shù)類型的癌癥中易阳，NETs評(píng)分與糟糕的預(yù)后有關(guān)（圖2B）。

????????為了檢驗(yàn)該特征的有效性和普遍性吃粒，作者在TCGA測(cè)試隊(duì)列中驗(yàn)證了NETs評(píng)分的預(yù)后效果潦俺。與訓(xùn)練集的結(jié)果一致，測(cè)試隊(duì)列中患者的生存分析顯示声搁，NETs評(píng)分越高黑竞，病情發(fā)展越差（圖2D）。多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型綜合了NETs評(píng)分和癌癥類型疏旨，表明NETs評(píng)分是TCGA測(cè)試隊(duì)列中患者總生存期的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素很魂。觀察到NETs評(píng)分對(duì)各種腫瘤的預(yù)后有相當(dāng)強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力（圖2E），包括KIRC檐涝、COAD和LUAD遏匆。然而，對(duì)于NETs評(píng)分相對(duì)較低的BRCA谁榜，NETs評(píng)分的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值無法在測(cè)試隊(duì)列中再現(xiàn)幅聘。作為女性最常診斷的癌癥，TCGA中有大量的BRCA樣本數(shù)據(jù)窃植，這就造成了訓(xùn)練隊(duì)列的模型有很高的統(tǒng)計(jì)效率和過度擬合的事實(shí)帝蒿。NETs評(píng)分對(duì)來自同一器官的癌癥有不同的影響，它與肺腺癌（LUAD）患者的不利預(yù)后明顯相關(guān)巷怜，但對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）患者則沒有影響葛超，盡管后者的NETs評(píng)分比前者高（圖2B），這表明NETosis在腫瘤進(jìn)展中的作用不僅受其所在器官的影響延塑，還與腫瘤的性質(zhì)有關(guān)绣张。

圖2 19種基因的NETs評(píng)分的預(yù)后性能

02 - 在其他獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證與NETs相關(guān)特征

????????為了進(jìn)一步確認(rèn)NETs評(píng)分的預(yù)后價(jià)值，作者將其應(yīng)用于多個(gè)外部驗(yàn)證隊(duì)列关带，并獲得了類似的結(jié)果侥涵。從CGGA數(shù)據(jù)庫中獲得了651名膠質(zhì)瘤mRNA矩陣和臨床信息的患者，NETs評(píng)分較高的膠質(zhì)瘤患者伴隨著較差的預(yù)后宋雏，尤其是那些高等級(jí)疾参咂（III級(jí)或IV級(jí)，圖3A）磨总。外部驗(yàn)證表明燃箭，NETs評(píng)分不是乳腺癌的可靠預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，因?yàn)樗?個(gè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中的7個(gè)中并不顯著（圖3B）舍败，這與TCGA隊(duì)列的驗(yàn)證結(jié)果一致招狸。收集了額外的NSCLC數(shù)據(jù)集以確認(rèn)NETs評(píng)分對(duì)LUAD和LUSC患者的不同預(yù)后效果敬拓，同樣發(fā)現(xiàn)NETs評(píng)分與LUAD患者的預(yù)后顯著相關(guān)（圖3C），但與LUSC患者無關(guān)（圖3D）裙戏。

圖3 外部隊(duì)列中NETs評(píng)分的預(yù)后表現(xiàn)

03 - 建立一個(gè)基于NETs評(píng)分的nomogram乘凸，用于臨床預(yù)測(cè)泛癌的生存率

????????為了給NETs特征提供一個(gè)可讀的定量測(cè)量，以臨床預(yù)測(cè)不良事件的概率累榜，構(gòu)建了一個(gè)綜合的nomogram营勤，將NETs評(píng)分和幾個(gè)臨床病理特征相結(jié)合，包括患者的年齡和癌癥類型（圖4A）壹罚。圖4B中繪制了3年DSS的校準(zhǔn)曲線葛作，幾乎與標(biāo)準(zhǔn)曲線相吻合，是一條斜率為1的直線猖凛，通過坐標(biāo)軸點(diǎn)赂蠢，表明nomogram的特征與實(shí)際生存概率非常接近。如圖4C所示辨泳，發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練集和測(cè)試隊(duì)列中虱岂，nomogram預(yù)測(cè)的AUC優(yōu)于單獨(dú)的NETs評(píng)分，表明在考慮各種臨床因素后菠红，nomogram的預(yù)測(cè)效率會(huì)更好第岖。此外，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的NETs評(píng)分和綜合列線圖的凈效益（NB）都高于0试溯，在DCA臨床評(píng)價(jià)中最大的NB大于15%（圖4D蔑滓，E），表明NETs評(píng)分與其他臨床特征協(xié)調(diào)對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)的重要性遇绞。

圖4 NETs評(píng)分和衍生列線圖特征在預(yù)測(cè)泛癌預(yù)后方面的有效性評(píng)估

04 - NETs特征和腫瘤的惡性特征

????????正常細(xì)胞在異化為惡性狀態(tài)的過程中键袱，獲得了快速增殖、活躍的EMT和血管生成试读，這是惡性腫瘤的標(biāo)志。為了研究NETosis和這些惡性特征之間的聯(lián)系荠耽，通過z-score算法量化了腫瘤在NETs促進(jìn)钩骇、血管生成、EMT和細(xì)胞周期方面的能力铝量。發(fā)現(xiàn)在整個(gè)TCGA泛癌隊(duì)列中（圖5A-C）倘屹，或在大多數(shù)腫瘤類型中（圖5D、E）慢叨，NETs z-score與血管生成z-core纽匙、EMT z-core和細(xì)胞周期z-core分別存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。換句話說拍谐，具有促NETosis的腫瘤一般伴隨著微環(huán)境中更活躍的血管生成和及更具侵襲性的腫瘤細(xì)胞烛缔。這些結(jié)果表明馏段，NETosis在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生得越活躍，惡性細(xì)胞的作用就越積極践瓷。

圖5 中性粒細(xì)胞外的陷阱得分與腫瘤的許多惡性特征高度相關(guān)

????????為了進(jìn)一步描述和比較高危和低卧合玻患者的腫瘤生物學(xué)行為和免疫微環(huán)境，從TCGA數(shù)據(jù)集中共提取了1599名LUAD晕翠、COAD喷舀、KIRC和TNBC患者。根據(jù)他們的NETs評(píng)分淋肾，按照最佳臨界值將每種類型的腫瘤患者分為高危和低危組硫麻。高危組和低危組之間的DEGs被應(yīng)用于GO富集分析。正如預(yù)期的那樣樊卓，DEGs的特征與NETs形成過程的特征一致拿愧，如中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞脫顆粒和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫简识，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的步驟赶掖，如細(xì)胞粘附、細(xì)胞外組織和細(xì)胞外基質(zhì)降解的正向調(diào)節(jié)（補(bǔ)充圖S6）七扰。

補(bǔ)充圖S6 DEGs的GO富集分析的代表性結(jié)果

05 - 與NETs相關(guān)的基因在臨床隊(duì)列中的重新構(gòu)建

????????建立NETs評(píng)分是為了根據(jù)幾個(gè)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平來評(píng)估腫瘤中的NETostic潛力奢赂。為了更好地闡明NETs與患者預(yù)后之間的關(guān)系，作者將MPO和H3Cit這兩個(gè)表明NETs形成的經(jīng)典NETs標(biāo)志物放入IHC驗(yàn)證中颈走，涉及的腫瘤類型不僅包括NETs評(píng)分與患者的預(yù)后顯著相關(guān)的KIRC膳灶、LUAD和COAD，還包括不相關(guān)的TNBC樣本立由。結(jié)果證實(shí)MPO的染色模式主要是在腫瘤浸潤(rùn)基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)烈而清晰（圖6A）轧钓，而在相鄰的正常組織中則非常罕見。因此锐膜，作者采用基質(zhì)細(xì)胞中MPO+細(xì)胞的比例得分（MPO得分）來衡量腫瘤組織中NETosis的程度毕箍。結(jié)果顯示，MPO評(píng)分可以對(duì)COAD道盏、KIRC和LUAD患者的預(yù)后進(jìn)行分層（圖6B-D）而柑，但在TNBC患者中不顯著（圖6E）。與TCGA隊(duì)列中BRCA相對(duì)較低的NETs評(píng)分一致荷逞，觀察到TNBC樣本的MPO染色率明顯低于LAUD媒咳、COAD和KIRC。然后對(duì)所有可用的臨床指標(biāo)進(jìn)行單變量Cox分析种远，如性別涩澡、年齡、腫瘤坠敷、結(jié)節(jié)妙同、轉(zhuǎn)移（TNM）階段和病理分化等射富，對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行后續(xù)多變量Cox回歸分析。如森林圖所示渐溶，MPO評(píng)分是影響COAD和KIRC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素（圖6F辉浦，G）。然而茎辐，作者發(fā)現(xiàn)在LUAD IHC隊(duì)列中宪郊，MPO評(píng)分與TNM分期明顯正相關(guān)，因此在多變量Cox模型中拖陆，MPO評(píng)分不是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素（圖6H）弛槐。

圖6 在臨床隊(duì)列中對(duì)MPO進(jìn)行IHC驗(yàn)證

????????由于NETs評(píng)分模型是一個(gè)由多基因組成的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，其中任何一個(gè)基因的表達(dá)水平都可能無法直接映射模型的預(yù)測(cè)依啰。例如乎串，由IL-17A編碼的IL-17被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞的招募者和NETs啟動(dòng)子，因此最初被納入模型的構(gòu)建中速警，作為促進(jìn)NETs形成的成分叹誉，然而IL-17A的系數(shù)在最終模型中變成了負(fù)數(shù)。推測(cè)可能與腫瘤組織中IL-17的來源廣泛有關(guān)闷旧，這使該基因的生物學(xué)效應(yīng)變得復(fù)雜长豁。IHC結(jié)果表明，IL-17由各種類型的細(xì)胞表達(dá)忙灼，包括腫瘤細(xì)胞匠襟，與以前的報(bào)道一致。在本研究隊(duì)列中该园，腫瘤組織中IL-17的總體水平與患者的臨床結(jié)果無關(guān)酸舍。然而，腫瘤基質(zhì)中IL-17+細(xì)胞的比例得分（IL-17評(píng)分）與MPO得分顯著相關(guān)里初】忻悖可能與MPO評(píng)分一致，IL-17評(píng)分也是COAD和KIRC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（補(bǔ)充圖S8A, B）双妨，因?yàn)镮L-17評(píng)分越高淮阐，OS就越短（補(bǔ)充圖S8C, D）。然而斥难，LUAD患者的情況并不樂觀枝嘶，這可能是由于MPO評(píng)分在本研究LUAD隊(duì)列中不是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素帘饶，如前所述哑诊。IL-17和MPO評(píng)分的構(gòu)成結(jié)果表明，是基質(zhì)細(xì)胞而不是其他細(xì)胞表達(dá)IL-17及刻，可能在促進(jìn)NETosis方面有重要作用镀裤。因此竞阐，像IL-17A這樣的單一基因在腫瘤組織中的整體表達(dá)水平可能不足以代表NETs評(píng)分模型的結(jié)果。

補(bǔ)充圖S8 IL17染色在腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中的IHC驗(yàn)證

四暑劝、結(jié)論

??????NETs評(píng)分是根據(jù)LASSO Cox模型基于19-NETs相關(guān)基因計(jì)算的骆莹。在大多數(shù)癌癥類型中，NETs評(píng)分被認(rèn)為是一個(gè)危險(xiǎn)因素担猛，得分越高表明不良結(jié)局越差幕垦。NETs與各種惡性生物過程顯著相關(guān)，例如上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化傅联，血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖先改。此外，在各種腫瘤的IHC隊(duì)列中蒸走，骨髓過氧化物酶（參與該模型的基因和NET形成的經(jīng)典代表）與不良的臨床結(jié)果相關(guān)仇奶。??

????????總之，腫瘤組織的NETs形成潛力與許多惡性特征高度協(xié)調(diào)比驻，并與泛癌癥患者的臨床結(jié)果有關(guān)该溯。對(duì)腫瘤病變中的NETs形成進(jìn)行評(píng)估和定位，可能會(huì)促進(jìn)癌癥的個(gè)性化治療别惦。